组织RNA提取试剂盒操作注意事项

1）Wash Buffer使用前需要按照标签上写的体积加入无水乙醇；

2）取组织需要尽量迅速，可以用液氮速冻，以避免RNA降解（RNA降解主要发生在取组织阶段）；

3）第一次做的时候，建议前两个样品按下表取相应重量的组织，称重，其余样品根据前两个样品体积来估计，切取相似大小即可；

4）组织称量好以后，放入破碎仪专用的2 ml离心管中，做好标记，每个加入500 ul裂解液，每管放入3~4粒钢珠，研磨3~4次（每次30 S，两次研磨中间停顿30S，以防长时间研磨产热过多导致RNA大量降解），至半透明状，看不到明显的组织固体为止。组织破碎仪的钢套最好提前预冷；

5）组织裂解后，吸出液体到1.5 ml离心管中，室温放置5分钟，充分裂解组织；

6）每个加入100 ul氯仿，上下颠倒10次充分混匀，然后室温放置3分钟。13000 rpm离心3分钟，使液体分层。轻轻的拿出离心管，避免晃动导致液体分层被打乱。吸取上清时，尽量小心操作，枪头随液面降低从上往下慢慢吸取上清，避免吸到中间层或者下层，建议吸取200 ul上清即可（RNA浓度已经完全足够使用），尽量不要多吸；

7）如果后续RNA用来检测mRNA等常规大小的RNA，则加入200 ul无水乙醇吹打混匀，即可加入离心柱。如果后续RNA用来检测microRNA等分子量很小的RNA，则需要加入320 ul无水乙醇吹打混匀（如果出现沉淀，需要吹打至沉淀不可见为止），然后加入离心柱中。

4000g（约6500 rpm），4度离心1分钟；

8）倒掉收集管中的液体，将收集管在吸水纸（擦手纸即可）上倒扣几下，将离心柱放回收集管，加入500 ul Wash Buffer 1，12000g， 4度离心1分钟，倒掉液体；

9）加入500 ul Wash Buffer 2，12000g， 4度离心1分钟，倒掉液体，然后在纸上倒扣几下收集管，将离心柱放回收集管，12000g 空柱离心1分钟以充分去除残留的废液；无需倒掉废液，直接将离心柱转移至无RNase的1.5ml EP管中（转移离心柱时尽量避免离心柱碰到侧壁或底部，以免废液污染了离心柱导致纯度降低）。

10）开盖晾干2分钟，加入20~30 ul Elution Buffer到离心柱中央的膜上，室温放置3分钟，12000g离心一分钟，即可得到RNA。

RNA应该立即放置于冰上，然后测浓度。通常Nanodrop曲线应为正态分布图样（260 nm处峰最高），260/280和260/230应介于1.9~2.2之间，表明纯度较高（最大不超过2.3）。

本试剂盒提取的RNA可用于临床体外检测使用，可以配套衔接的下游实验类型包括但不限于逆转录、qPCR，二代测序、RNA芯片、RNA甲基化检测等各种实验。

细胞RNA提取试剂盒操作注意事项与技巧

1）Wash Buffer使用前须加入瓶身标签所示体积的无水乙醇混匀才可使用。

2） 建议使用前把Elution Buffer分装为3~4份，以减小污染的概率；暂时不用的Elution Buffer可以冻存在-20度长期保存。做实验时恢复到常温再使用即可。如果把Elution Buffer在金属浴上提前预热到60度，然后再加入柱子膜中央使用，则能适当提高RNA产量。

3） RNA提取须在室温进行，提取过程中不可置于冰上。

4） 建议用6孔板或35 mm培养皿培养细胞，培养至贴壁细胞密度达到80%以上时进行RNA提取，不建议用100 mm培养皿培养的细胞直接裂解提取RNA，否则可能导致细胞裂解不充分或离心柱堵塞或导致基因组残留。

5） 裂解时注意事项：

a) 弃去培养基，用PBS清洗细胞（沿侧壁加入PBS轻轻晃动后，再沿侧壁吸去PBS；如果样品数较多，应分批操作，以防止因细胞晾干导致RNA严重降解）；

b) 加入500 μl裂解液（Lysis Buffer），将移液器量程调至400 μl后吹打30下（吹时，液体不要完全吹出，枪头内可以留一点；吸时，液体也不要完全吸完，防止吸入气泡）；或加入裂解液后将孔板吹打数次后置于水平摇床上室温摇4~5分钟，然后吹打10下，以使细胞充分裂解。

6） 加入裂解液充分裂解以后，如果不打算继续进行RNA提取，可在充分裂解后将裂解产物转移到EP管中直接冻存在-80℃，下次解冻后恢复到室温使用，加乙醇混匀，继续向后进行即可。

7） 洗涤时注意事项：

a) 加入500 μl洗涤液（Wash Buffer）到离心柱中，12000 g离心1分钟。注意：将离心柱从收集管中取出时，应小心操作，防止离心柱底部接触到液体（建议操作：倒掉液体后，可将收集管倒扣在吸水纸上轻轻叩击两下，然后将离心柱放回收集管，12000 g空柱离心1分钟）；

b) 无需倒废液，直接将离心柱取出转移至无RNase的1.5 ml EP管中，开盖晾干2分钟。

8） RNA洗脱时一定要将洗脱液加到柱中央的膜上（如果洗脱液加到侧壁上，会导致RNA没有被溶解而使产量大大减少），同时注意避免移液器枪尖将膜刺破。

9） RNA提取后应该立即放置于冰上，然后测浓度。通常Nanodrop曲线应为正态分布图样（260 nm处峰最高），260/280和260/230应介于1.9~2.2之间，表明纯度较高。

10） 本试剂盒提取的RNA可用于临床体外检测使用，可以配套衔接的下游实验类型包括但不限于逆转录、qPCR检测等各种实验。如果想用于二代测序则建议使用组织RNA提取试剂盒（亦可提取细胞）。